常规测序中常见峰图分析

1. 克隆测序时出现峰形重叠

    原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染。

    解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

    在峰图上常表现为左边清晰干净，右边双峰且信号比左边的低一倍。峰图如下：

2. PCR产物测序时出现重叠峰

    主要分为三种情况：

    第一种情况：模板中有碱基缺失，往往是单一位点或多个位点碱基缺失导致测序结果移码（如图1和图2）。

    解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

图1

图2

    第二种情况：PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一。

    解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

    第三种情况：测序引物有碱基缺失

    测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

    解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。

3. 整个峰图噪音比较高

    原因：a. 引物特异性不好 b. 模板加量不合理。

    解决方案：重新设计引物或者调整模板量。下面图A和图B都是同一模板，不同引物的测序列结果对比。

图A

图B

4. 测序无信号

    原因：模板上无引物结合位点。

    解决办法：重新核对引物，重新设计或者合成引物。

5. 钉字峰

    原因：毛细胞管内有气泡、灰尘、尿素结晶，对激光全反射造成的。

    解次方案：重新对样品做反应毛细电泳。