基因组DNA提取常见问题分析

1、未提取到DNA

原因分析：漂洗液中忘记加无水乙醇

建议解决方案：第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。

2、血液标本中含有血凝块

原因分析：不恰当的存放标本，未充分混匀，未使用合适的抗凝收集管

建议解决方案：丢弃有血凝块的标本，重新用EDTA、肝素、柠檬酸抗凝管收集血液。

3、红细胞裂解不完全

原因分析：血液标本裂解前没有恢复到室温

建议解决方案：处理前先把血液标本恢复到室温。

原因分析：裂解时间不够

建议解决方案：可延长裂解时间至15分钟以上。

原因分析：裂解过程中没有多次混匀

建议解决方案：裂解过程中可以更多次颠倒混匀，或者轻弹管壁帮助裂解。

4、DNA产量低

原因分析：血液标本中含有白细胞数量低

建议解决方案：增加起始血液处理量。

原因分析：裂解不完全

建议解决方案：加裂解液前打散细胞团；适当增加裂解液体积；使用配套的裂解液。

原因分析：样品存放的时间太长

建议解决方案：尽量使用新鲜样品；

原因分析：组织块太大，蛋白酶K消化不完全

建议解决方案：液氮研磨、将组织切成小块，或者延长蛋白酶K消化时间

原因分析：和异丙醇没有充分混匀

建议解决方案：加入异丙醇后，和裂解物混匀后才加入吸附柱。

原因分析：洗脱效率不高

建议解决方案：使指定配套的洗脱缓冲液EB洗脱。

原因分析：蛋白酶K失效

建议解决方案：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分装冻存，避免反复冻融。

原因分析：DNA沉淀在洗涤时丢失

建议解决方案：异丙醇沉淀后用乙醇洗涤的过程中，倒弃上清的时候要格外小心。

原因分析：使用水或者其它非最佳液体洗脱

建议解决方案：使用配套的洗脱缓冲液

原因分析：试剂盒储存在非最佳条件

建议解决方案：收到试剂盒后总是存放在室温（15℃-20℃）。

原因分析：样品处理困难

建议解决方案：尽量将材料研磨细，匀浆完全。

5、DNA长度小于20kb

原因分析：DNA降解，样品存放太久或者未正确存放

建议解决方案：选用新鲜样品。

原因分析：操作不当，造成对基因组DNA的剪切

建议解决方案：混匀轻柔，不可以用手剧烈振荡离心管，选用大口径的吸头转移或者混匀DNA。

6、A260/A280<1.6

原因分析：有蛋白质污染

建议解决方案：保证重复的裂解液用量和时间，确保蛋白通过沉淀去除。

原因分析：测定吸光值时用水稀释DNA

建议解决方案：使用TE缓冲液来稀释DNA，保证pH值大于8.0。

原因分析：DNA没有完全溶解

建议解决方案：重新溶解DNA。

7、A260/A280>1.9

原因分析：RNA酶处理时间不够

建议解决方案：加大RNA酶用量或者处理时间延长。

原因分析：DNA剪断

建议解决方案：严格按照操作步骤，动作不可以太剧烈。

8、未见到蛋白沉淀

原因分析：加入蛋白沉淀液前，裂解混合物没有冷却至室温

建议解决方案：冷却至室温或者冰上放置5分钟后再加入蛋白沉淀液。

原因分析：蛋白沉淀液未与裂解混合物充分混匀

建议解决方案：应该连续高速涡旋振荡混匀25秒。

9、下游酶切切不开

原因分析：DNA未干燥完全，残留乙醇太多

建议解决方案：敞开离心管口，在65℃温育几分钟，让乙醇挥发。

原因分析：硅基质膜成分一起洗脱下来

建议解决方案：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。

10、PCR反应受抑制

原因分析：BSA没有加到PCR反应体系

建议解决方案：PCR反应体系中加入终浓度0.1μg/μl的BSA。

原因分析：非特异性扩增条带

建议解决方案：洗脱液中目的DNA量太低，背景DNA过高，建议使用热启动PCR聚合酶。

11、离心柱堵塞

原因分析：裂解物太粘稠

建议解决方案：减低起始材料量，不要处理过量。

原因分析：离心力太小

建议解决方案：加大离心力。

如果您还有其他技术疑问，欢迎随时拨打技术热线：010-52609502转8007；也可把您的技术问题发送到技术部邮箱：biomedsupport@163.com。