EasyMut基因多点突变试剂盒
产品信息：
产品储存：请按产品指示温度保存各成分
产品介绍：
本产品利用无缝克隆技术来实现基因的定点突变，可用于单点突变和多点突变质粒的构建。本产品无需除去甲基化模板质粒，无需PCR扩增出整个质粒，并且引物设计更加简便快速，因此可以更加快速，高效地实现定点突变。
产品特点：
1. 利用2×Xerox PCR Master Mix扩增片段，缩短扩增时间（2-4 kb/min），提高保真性；
2. 引物设计更加简单，快速；
3. 省略消化甲基化模板质粒的步骤，更加快速，高效；
4. 无需PCR扩增出整个质粒，减少载体的突变。
实验原理：
实验步骤：
一、突变位点的引物设计
1. 突变位点引物设计要求 ：
（1）在每个突变位点处需设计一对引物，且突变位点在重叠区约中部位置。可以先设计正向引物，然后通过反向互补得到反向引物。
（2）引物的长度通常为30-40个碱基，突变位点两侧的碱基数在15-20个左右，GC%含量在40%-60%为最佳。
（3）避免引物末端为重复序列。
2. 引物设计示例：
（1）单点突变引物设计：如图1
图1
（2）多点突变引物设计：如图2
图2
二、突变片段的制备
1. PCR扩增
（1）PCR扩增体系
（2）PCR扩增条件
注意：为了获得更高保真性的扩增产物，采用高浓度模板和少量PCR循环数组合的扩增方法。
2. 纯化片段
（1）电泳检测：取10 μl PCR产物，根据片段大小选择合适浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。
（2）如果扩增片段单一，建议用PCR产物纯化回收试剂盒纯化片段；如果有非特异扩增，建议使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂回收片段。
三、线性化载体的制备
可以通过酶切或PCR扩增的方法来制备线性化载体，且最好使用空载体质粒进行酶切或PCR扩增。
1. 酶切获得线性化载体
利用单酶切或双酶切对空载体进行线性化处理，一般双酶切比单酶切线性化效果好。载体的完全线性化是无缝连接成功的关键。单酶切或双酶切方式制备的线性化载体无需进行末端脱磷酸化处理。通过电泳方法判定载体线性化是否完全时，一定要用未酶切的质粒做对照一起电泳。酶切完成后建议采用胶回收方法纯化线性化载体。
2. PCR扩增制备线性化载体
以空载体质粒为模板，设计一对引物用高保真DNA聚合酶（如Xerox）扩增，制备用于重组的线性化载体。为防止残留环状载体质粒对克隆阳性率的影响，可以采用胶回收方法或者Dpn I消化结合胶回收的方法纯化线性化载体。
四、突变片段与线性化载体的重组连接
连接体系：
轻轻混合，50℃反应15 min（2-3个片段，15 min；4个片段以上，60 min），反应完成后，将离心管放在冰上数秒。
连接产物可直接用于转化或放于-20℃保存。
五、转化
1. 从-80℃冰箱中拿出感受态细胞，放于冰上溶解；
2. 取5-10 μl连接产物加入到刚化冻的50 μl或100 μl感受态细胞中，轻轻混匀；
3. 冰上静置20-30 min；
4. 42℃，热击90 sec；
5. 冰上放置2 min；
6. 加入900 μl无抗性的LB液体培养基，200 rpm，37℃，培养60 min；
7. 4000 rpm 离心1 min，弃掉部分上清，保留100-200 μl，用吸头吹打悬浮菌体，取100 μl菌液涂在相应抗性板上，37℃倒置培养过夜。
六、阳性克隆鉴定
1. 菌落PCR方法；
2. 限制性酶切分析方法；
3. DNA测序方法
常见问题及解决方法：
1. 转化后没有克隆或克隆数少
（1）感受态细胞效率降低，请用pUC19检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在
108 cfu/μg以上。
（2）PCR扩增的突变片段产物进行胶回收纯化，确定其条带的大小和单一性。
2. 转化后菌落有很多空载体质粒
这种情况主要是由于线性化载体制备不好造成的。鉴定一下质粒的质量，保证质粒完全酶切。如果内切酶无效也会产生这种现象。
3. 测序没有信号
（1）检查送测序的质粒和原始质粒酶切后是否大小完全一致 。
（2）用测序引物对原始质粒测序，验证测序引物的有效性。
