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复杂结构测序
发布者:博迈德生物2018-01-182801
由于二级结构或者其它内在因素的影响,复杂结构对于测序是巨大的挑战。常规的测序方案往往容易出现提前中断或者测序结果紊乱的现象。
样品的复杂结构主要有以下几种情况:
1. Poly结构:一般认为7个以上碱基的重复就可以称之为poly结构。
PolyA/T结构通常致其后的峰图出现重叠峰,PolyG/C结构通常致其后的峰图出现信号衰减。Poly结构是导致测序失败最常见的原因之一,还没有非常有效的方法彻底解决Poly结构的影响,但一般而言,PCR样品Poly结构后双峰的概率比较高,而菌液中Poly结构对测序结果的影响较少或没有。
解决办法:1.反向测序再拼接 2.连接到载体后测序
2. 重复序列:2个或2个以上碱基的多个连续重复。
可能的原因:样品中含有重复序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样,会导致Frame滑动,较短的重复序列会导致测序结果出现移码;而较长的重复序列会使定序信号衰减。
解决办法:反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域(但不是一定都能够),通过多次的测序结果比对,拼接可以得到全序列结果。
3. 高GC含量:GC含量>60%的模板,或者局部高GC含量的模板。
采用普通测序Buffer,结果很不理想;用高GC Buffer等进行系统优化后,往往能达到理想的效果。下面三组图片,是我们公司对高GC含量基因测序过程中优化前后的对比图。
图1
图2
图3
4. 发夹结构:包含两个反向重复序列,两个重复序列之间间隔至少3个碱基。
在测序中,有这种结构的存在是导致测序列失败。到目前为止,也是测序列中遇到的一个题。我们公司采用特殊的Buffer进行了优化,测序列效果有了很大的转让变,但并能保证所有的发夹结构都能顺利测出序列,尽我们最好的努力来为您决测序列中您遇到的难题。下面的A、B个图片分别是优化前后的对比:
图A
图B
- •NEB5αF´ Iq 感受态细胞 ...
- •Lipo3000 Transfection Reagent...
- •Lipo2000 Transfection Reagent...
- •12% 彩色(绿色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •10% 彩色(蓝色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •8% 彩色(红色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •UVFS 蛋白凝胶染色剂...
- •10-250KD (+40KD) Prestained Protein Ladder...
- •10-180KD Prestained Protein Ladder...
- •小鼠基因型快速鉴定试剂盒...
- •氯仿替代物...
- •Bsu DNA Polymerase (Large Fragment)...
- •T4 gene 32 protein (gp 32)...
- •T4 UvsY Recombinase (T4重组酶辅助蛋白)...
- •T4 UvsX Recombinase (T4重组酶)...
- •NEB5αF´ Iq 感受态细胞 ...
- •Lipo3000 Transfection Reagent...
- •Lipo2000 Transfection Reagent...
- •15% 彩色(紫色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •12% 彩色(绿色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •10% 彩色(蓝色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •8% 彩色(红色)免染PAGE胶一步法快速制备试剂盒...
- •UVFS 蛋白凝胶染色剂...
- •10-250KD (+40KD) Prestained Protein Ladder...
- •10-180KD Prestained Protein Ladder...
- •小鼠基因型快速鉴定试剂盒...
- •氯仿替代物...
- •Bsu DNA Polymerase (Large Fragment)...
- •T4 gene 32 protein (gp 32)...
- •T4 UvsY Recombinase (T4重组酶辅助蛋白)...