技术服务

services

·DNA常规测序

常规测序中常见峰图分析

发布者:博迈德生物2018-01-181477


1. 克隆测序时出现峰形重叠

    原因:所挑选的重组子不是单克隆,所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒;或是是送测序的菌液污染。

    解决方法:重新挑单克隆的菌落(划线分离单菌落),提质粒或送菌液再次测序。

    在峰图上常表现为左边清晰干净,右边双峰且信号比左边的低一倍。峰图如下:


2. PCR产物测序时出现重叠峰

    主要分为三种情况:

    第一种情况:模板中有碱基缺失,往往是单一位点或多个位点碱基缺失导致测序结果移码(如图1和图2)。

    解决方法:将PCR产物克隆到质粒(如T载体)中挑单克隆测序,或将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。


图1


图2


    第二种情况:PCR产物不纯,含部分序列一致的两种以上的片段,长度不一。

    解决方法:主要原因是PCR产物没有纯化,含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段,将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序,便可解决。


    第三种情况:测序引物有碱基缺失

    测序引物有碱基缺失(一般是引物的5'端缺失),和模板的碱基缺失有些类似,所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码,而引物碱基缺失的话,则从测序一开始就出现移码,表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

    解决方法:重新合成引物,或将引物进行PAGE纯化。



3. 整个峰图噪音比较高

    原因:a. 引物特异性不好 b. 模板加量不合理。

    解决方案:重新设计引物或者调整模板量。下面图A和图B都是同一模板,不同引物的测序列结果对比。


图A


图B


4. 测序无信号

    原因:模板上无引物结合位点。

    解决办法:重新核对引物,重新设计或者合成引物。


5. 钉字峰

    原因:毛细胞管内有气泡、灰尘、尿素结晶,对激光全反射造成的。

    解次方案:重新对样品做反应毛细电泳。